单细胞基因组测序

经典案例

案例一 单精子全基因组测序探索染色体重组

Probing Meiotic Recombination and Aneuploidy of Single
Sperm Cells by Whole-Genome Sequencing

期刊:Science
影响因子:33.611
发表单位:北京大学
发表年份:2012年12月

一、研究背景

减数分裂期间同源染色体之间存在片段交叉重组(crossover)事件,染色体重组意味着遗传物质的分离交换,是产生生物多态性的重要遗传机制。在全基因组范围内,重组位点并非均匀分布,而是集中在一些散布的狭小区域内(hotspot),并且不同物种以及同一物种不同个体重组位点也存在明显差异。

传统的人类染色体重组研究,采用染色体核型分析技术,受实验技术的限制,分辨率较低;另外,由于一个家庭内的孩子数目有限,以往的研究都是在群体水平上开展的,而无法开展个人水平的遗传重组规律研究。单细胞DNA扩增技术和高通量测序技术的发明,使得测序单个精子的基因组成为可能。

二、方法流程

取材

对一名亚洲男性及其99个精子进行了单细胞全基因组测序

测序

1. Illumina HiSeq 2000
2. 单细胞全基因组测序:
体细胞(70×);
93个精子(1×);
6个精子(5×)。

分析

1. 与人类参考基因组(hg19)进 行比对
2. SNP检测
3. 单体型分析

三、研究结果

1. SNP检测及重组定位

检测到SNP约2.8M个,其中约1.4M个为杂合SNP。同时分析变异计算重组率,约1.1M的杂合SNP进行了定位,构建了迄今为止重组定位精度最高的个人遗传图谱,定位的准确率为99.5%。研究发现个体水平上基因区附近的重组率有降低的现象,证明了这一现象是由分子机制决定,而非自然选择的结果。

2. 染色体非整倍性

本研究还发现5%的精子(4个)染色体数目发生异常,即染色体组非整倍体。其中S39精子的19号染色体发生了缺失,S39精子的6号染色体发生了二倍化。前人研究表明,染色体数目异常是造成某些先天性出生缺陷的重要原因。

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四、研究结论

本研究采用最新发明的多重退火环状扩增循环技术(MALBAC),对一名亚洲男性及其99个精子进行了组织及单细胞全基因组测序,测序深度分别为70×和1×,构建了个人遗传图谱,并分析减数分裂期间同源染色体之间的片段交叉重组(crossover)事件。研究表明个体水平上基因区附近的重组率降低现象是由分子机制决定,而非自然选择的结果。染色体数目异常是造成某些先天性出生缺陷的重要原因。这一研究结果将有助于研究人类染色体重组规律,探索先天性出生缺陷的遗传机理。

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案例二 单细胞全基因组及外显子组测序揭示乳腺癌克隆进化模式

Clonal Evolution in Breast Cancer Revealed by Single Nucleus Genome Sequencing

期刊:Nature
影响因子:41.456
发表单位:The University of Texas MD Anderson Cancer Center, Department of Genetics
发表年份:2014年8月

一、研究背景

大量的乳腺癌研究已鉴别出许多普遍的基因突变,但是对于肿瘤基因组多样性的研究知之甚少。在乳腺癌的5种分子亚型中,ER-/PR-/Her2-亚型具有的突变数量最多,而ER+/PR+/Her2-亚型突变负荷最低,两者在克隆结构多样性及变异进化上可能存在不同。

二、方法流程

取材

1位ER+/PR+/Her2-亚型(ER)患者和1位ER-/PR-/Her2-亚型(TNBC)乳腺癌患者

测序

1. Illumina HiSeq 2000
2. ER
WGS:tumor 46×、normal 54×
CNV检测:50个肿瘤单细胞
WGS:4个肿瘤单细胞
WES:59个肿瘤单细胞
3. TNBC
WGS:肿瘤组织(72×);正常组织(74×)
WES:16个正常单细胞;16个肿瘤单细胞

分析

1. 与人类参考基因组进行比对
2. 检测somatic mutation
3. 高频突变基因筛选
4. 克隆进化分析
5. 肿瘤单细胞之间及肿瘤单细胞与肿瘤组
    织间相同/特有突变

三、研究结果

1. 克隆多样性和突变进化

通过肿瘤细胞之间的比较发现没有两个单细胞突变信息是完全一致的。在两个患者中发现有大量的各自的亚克隆和de novo突变,说明点突变是一个伴随着肿瘤细胞分裂增殖长期累计的过程,最终导致克隆的多样性。研究还发现,拷贝数的进化相似度很高,说明染色体重排发生较早。

2. 耐药突变与化疗

本研究发现大量的耐药突变存在于化疗前的肿瘤组织中,同时也发现增变基因表型有重要含义,指出肿瘤的进化是由增长的突变率驱动的。

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四、研究结论

通过对ER-/PR-/Her2-及ER+/PR+/Her2-两种分子亚型的患者成对采集肿瘤及正常组织样品,对肿瘤组织、肿瘤单细胞分别进行全基因组及外显子组测序。研究发现CNV在单细胞测序结果之间表现出高度相似性,提示染色体重排发生时期较早,在克隆发展过程中稳定传递给子代克隆;SNV在子代克隆间表现出多样性,提示SNV是在肿瘤细胞多次分裂增殖的过程中逐渐产生和积累的。此外,通过数学模型和生物信息学手段揭示了两种分子亚型的肿瘤在突变率上存在差异。

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